王　琦1,　郑行望1,　章竹君1,　王晓兰2(1陕西师范大学化学与材料科学学院,陕西西安710062;2陕西教育学院生化系,陕西西安710061)

　　鲁米诺电化学发光体系除具有电化学发光方法普遍所具有的灵敏度高、重现性好、发光反应可控制性强,而且在提高选择性方面也有有利的因素等优点外,还具有发光量子产率高、氧化电位低、试剂稳定、对溶液中的氧气等杂质的“容忍”程度强等自身特有的优点,因而受到人们的广泛关注.目前,鲁米诺电化学发光体系已被成功的用于许多无机物和有机物的分析,并取得了良好的分析特性。但是,国内外对鲁米诺电化学发光体系的研究和应用大多都集中于在各种不同的电极材料上电氧化鲁米诺进行发光分析的研究,对基于电还原鲁米诺电化学发光分析法,仅有Ｓ.Ｋｕｌｍａｌａ在1996年曾经报道过将鲁米诺作为发光标记物,在氧化铝电极上电还原鲁米诺进行免疫分析测定鲁米诺的研究.还未见基于以鲁米诺作为发光物在各种材料的电极上电还原鲁米诺进行电化学发光分析的研究.我们发现,当传统的碳糊电极中含有少量的ＣＴＭＡＢ时,鲁米诺在该修饰电极上的弱电化学还原电化学发光信号被Ｈ2Ｏ2所增敏.据此建立了一种新的测定过氧化氢的电化学发光分析方法.我们的研究结果进一步表明该方法与基于电氧化鲁米诺电化学发光法相比,因多数物质不能和鲁米诺在还原条件下所发光,所以该体系在测定条件下所受到的干扰较少,显示出较好的选择性.
2　试验部分
2.1 试剂
　　鲁米诺(Ｌｕｍｉｎｏｌ)贮备液:1×10-2ｍｏｌ/Ｌ,称取鲁米诺1.100%0ｇ(自制)用1ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液溶解后,配制成1Ｌ溶液,贮于棕色瓶中避光保存.配制1×10-2ｍｏｌ/Ｌ过氧化氢储备液,用时稀释至所需浓度.所用介质为饱和硼砂,所用其他试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水.
2.2 仪器
　　ＤＪＳ292恒电位仪(上海雷磁仪器厂)和一台超低频信号发生器用于调节、控制各种电解信号.微机控制式ＩＦＦＬ型超微弱化学发光分析仪(Ｒ456光电倍增管)用于检测和记录电化学发光信号.电解池是由一容量为10ｃｍ3的称量瓶加工而成.其中三电极系统的工作电极为修饰碳糊电极(面积为1.8ｃｍ2),辅助电极为铂丝电极(面积为2.0ｃｍ2),参比电极为Ａｇ/ＡｇＣｌ标准参比电极.
2.3 碳糊电极的制作方法
　　将5.00ｍＬ1×10-3ｍｏｌ/Ｌ鲁米诺溶液加入到5.0ｇ碳粉中,然后加入大约40ｍＬ丙酮,搅拌几小时使丙酮挥发.待丙酮快挥发完时,将此糊状溶液在60℃下烘干以除去丙酮.在此含有鲁米诺的干碳粉中加入2.5ｍＬ液体石蜡(碳粉∶石蜡约为3∶1),在研钵中充分研磨1ｈ,放置一段时间后,再充分研磨1ｈ,从而获得组成均匀的碳糊.将此碳糊紧密填入一长5ｃｍ,直径为3ｍｍ,中间插一铁钉的塑料圆管的一端(铁钉直径和塑料管的直径相匹配),填装长度为3ｍｍ,铁钉上连有铜丝导电,将电极表面在光滑的纸上刨光备用.为了改变鲁米诺的发光微环境,在液体石蜡中事先加入0.5%的ＣＴＭＡＢ.

　　

2.4 分析方法
　　将鲁米诺和ＣＴＭＡＢ修饰的碳糊电极置于饱和硼砂空白溶液和含有过氧化氢的样品溶液的电解池中,施加阶跃电位0～-0.9Ｖ于工作电极,记录体系的空白电化学发光强度值和样品的增强电化学发光强度值,并以相对电化学发光强度的峰值高度进行样品的定量分析.
3　结果与讨论
3.1 介质的的选择
　　介质不仅影响过氧化氢电化学发光反应,而且影响电化学发光分析的重现性.我们分别考察了硼砂缓冲液(饱和)、Ｎａ2ＣＯ3(0.1ｍｏｌ/Ｌ)、ＮａＨＣＯ3(0.1ｍｏｌ/Ｌ)、ＮａＯＨ(0.1ｍｏｌ/Ｌ)等介质对以上两方面分析特性的影响,信噪比分别为8 6,0 82,1 14和4 38.可见以硼砂为介质时,过氧化氢的增敏电化学发光信号与鲁米诺的空白电化学发光信号的信噪比最大,且重现性较好.因此,采用饱和硼砂缓冲溶液为介质
3.2　电化学参数的选择
3.2.1　电解方式的选择
　　　电化学发光的分析特性与激发信号的施加方式关系密切,其主要原因是电生发光物的产生速度、在扩散层中的动态分布和电化学反应与化学发光反应的匹配程度等步骤受电化学激发信号的方式的调控.我们研究了电位线性扫描、脉冲电解、单阶跃和循环伏安电解方式对电化学发光信号的影响,得到的信噪比分别为1.42,1.61,2.25,1.48.结果表明,单阶跃扫描方式呈现出更好的电化学发光分析特性(见表1),所以选择扫描方式为单阶跃进行过氧化氢的电化学发光分析研究.

　　

3.2.2 终止电位的选择
　　　在不同的终止电位下测定过氧化氢增敏的电化学发光信号与鲁米诺的空白电化学发光信号的信噪比.结果表明,当终止电位为-0.3Ｖ和-0.5Ｖ时,反应体系的信噪比较小;当终止电位变为-0.9Ｖ时,增敏的电化学发光信号的信噪比最大;电位变为-1.1Ｖ和-1.3Ｖ时,增敏的电化学发光信号的信噪比又开始下降,所以选择终止电位为-0.9Ｖ.
3.3 鲁米诺浓度的选择
　　鲁米诺浓度是影响过氧化氢增敏电化学发光信号的重要条件,它决定着过氧化氢增敏电化学发光信号与鲁米诺的背景电化学发光的信号强度的信噪比.研究结果显示,将1.0×10-4ｍｏｌ/Ｌ的鲁米诺固定在碳糊中,过氧化氢的电化学发光增敏作用最强.
3.4 ＣＴＭＡＢ含量的选择
　　固定于碳糊中的鲁米诺的弱电化学发光信号受过氧化氢的增敏,且其增敏作用与表面活性剂(ＣＴＭＡＢ)的量有关.表面活性剂修饰电极所提供的发光反应微环境更有利于过氧化氢增敏鲁米诺的电化学发光反应过程.我们分别考察了0.10%(石蜡∶ＣＴＭＡＢ,质量比)、0.30%、0.50%和0.70%的ＣＴＭＡＢ测定过氧化氢增敏的电化学发光信号与鲁米诺的空白电化学发光信号的信噪比.结果表明,当ＣＴＭＡＢ的含量为0.50%时,过氧化氢增敏的电化学发光信号与鲁米诺的空白电化学发光信号的信噪比最大,且实验数据的重现性较好,所以选择0.50%ＣＴＭＡＢ.
3.5 分析特性
　　在最佳实验条件下,获得增敏电化学发光信号强度(ΔＩＥＣＬ)与过氧化氢的浓度ｃ的校准曲线,校准曲线上的9个点均为8次测定的平均值,相对标准偏差不大于3.2%.实验结果表明,过氧化氢的浓度在1.0×10-5～6.0×10-4ｍｏｌ/Ｌ范围内与ΔＩＥＣＬ呈线性关系,检出限为7.3×10-6ｍｏｌ/Ｌ.回归方程为ΔＩＥＣＬ=23.55ｃ+1.05(ｃ:10-4ｍｏｌ/Ｌ),相关系数为0.9919.
3.6 干扰实验
　　考察了10多种共存离子的影响,对于5.0×10-5ｍｏｌ/Ｌ的过氧化氢,测定误差≤5%,下列共存离子(ｇ/ｍＬ)不干扰测定:Ｋ+,Ｎａ+,Ｃａ2+,Ｍｇ2+,ＮＯ-3,ＣｌＯ-3,草酸(1000);Ｃｕ2+,Ｍｎ2+,(500);柠檬酸,ＥＤＴＡ(100);Ｃｏ2+(0.5);Ｆｅ3+,苯甲酸,抗坏血酸等量时仍干扰.方法有较好的选择性,对于复杂样品的测定需采用适当的分离手段.
3.7 分析应用
　　为了考察该方法的可靠性,我们对医用过氧化氢消毒液中过氧化氢的含量进行了测定,结果见表2.实验结果验证了方法的准确性.